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Il museo ha sede nell’antico Cenacolo del convento agostiniano annesso alla chiesa di Santo Spirito, ceduto al Comune di Firenze nel 1868, a seguito della soppressione delle corporazioni religiose attuata dallo Stato Italiano. Costruito nel XIV secolo, il Cenacolo è l’unico ambiente del primo nucleo del complesso che conserva la struttura originaria. Ricorda la sua antica funzione di Refettorio il grande affresco di Andrea Orcagna e aiuti, raffigurante la Crocifissione e l’Ultima Cena, che occupa l’intera parete orientale, una delle più vaste pitture murali del Trecento giunte fino ai nostri giorni, nonostante le mutilazioni subite nella parte inferiore.